ІФА (імуноферментний аналіз, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – це лабораторний метод, що базується на специфічній реакції антиген-антитіло. Він призначений для якісного і кількісного визначення пептидів, білків, антитіл та гормонів у крові. Інші назви, такі як ферментний імуноаналіз, також використовуються. В ІФА антиген іммобілізується на мікропланшеті, після чого з’єднується з антитілом, пов’язаним з ферментом. Виявлення здійснюється через вимірювання активності ензиму.

У процесі ІФА антиген, або цільова макромолекула, іммобілізується на твердій поверхні (мікропланшеті). Після цього він з’єднується з антитілом, яке має зв’язок з ферментом-репортером. Виявлення речовини здійснюється шляхом вимірювання активності цього ферменту під час інкубації з відповідним субстратом, що призводить до утворення вимірюваного продукту.

Принцип роботи ІФА методу

Метод ґрунтується на специфічній взаємодії антиген-антитіло з подальшим виявленням комплексу за допомогою ферментної мітки. Основні етапи аналізу включають:

  • Іммобілізацію антигену або антитіла на поверхні планшета
  • Додавання досліджуваного зразка
  • Виявлення зв'язаних комплексів за допомогою ферментної мітки
  • Візуалізацію результатів за зміною кольору

Сфери застосування ІФА

  • Діагностика інфекційних захворювань (ВІЛ, гепатити, COVID-19)
  • Визначення гормонального статусу
  • Алергологічні дослідження
  • Онкомаркери
  • Діагностика аутоімунних захворювань

Переваги методу ІФА

  • Висока чутливість (до 0,1 нг/мл)
  • Відмінна специфічність
  • Можливість масових досліджень
  • Об'єктивність результатів
  • Автоматизація процесу

Ключовим аспектом ІФА є висока специфічність взаємодії між антитілом та антигеном, що забезпечує точність і надійність методу.

Імуноферментний аналіз крові: прямі, непрямі і багатошарові методи

Імуноферментний аналіз (ІФА) використовує різні формати, які діляться на три основні види: прямі, непрямі та багатошарові методи. Ключовий етап всієї процедури — це іммобілізація антигена. Цей процес може здійснюватися або через пряму адсорбцію на планшеті, або опосередковано через антитіло, яке прикріплюється до планшета.

Після цього антиген можна виявити безпосередньо, використовуючи мічене первинне антитіло, або побічно — за допомогою міченого вторинного антитіла. Найбільш поширеним методом є багатошаровий ІФА, також відомий як "сендвіч"-аналіз, який передбачає непряму іммобілізацію та визначення цільового антигену.

У цьому випадку аналізований аналіт зв'язується між двома первинними антитілами, кожне з яких розпізнає свій епітоп антигену: антитілом захоплення та антитілом детекції. Сендвіч-метод ІФА здобув популярність завдяки своїй високій чутливості та специфічності.

Прямі та непрямі стратегії в аналізі ІФА

У методі прямого виявлення застосовується первинне антитіло, яке містить фермент-репортер або іншу мітку, й взаємодіє прямо з антигеном. Це виявлення можливе на основі антигену, зафіксованого на аналітичній пластині, або у форматі аналізу захоплення. Хоча прямий метод не є поширеним в ІФА, він використовується у імуногістохімічному забарвленні клітин і тканин, де його ефективність досить висока.

Непряме виявлення передбачає використання міченого вторинного антитіла або комплексу біотин-стрептавідин для підсилення сигналу. Цей метод є найпопулярнішим форматом в ІФА. Вторинне антитіло має специфічність до первинного антитіла. В сендвіч-ІФА критично важливо, щоб воно було специфічним лише до первинного антитіла, адже в іншому випадку аналіз не дасть точних результатів. Для цього зазвичай використовують антитіла захоплення та первинні антитіла з різних видів, наприклад, IgG миші та IgG кролика. Для забезпечення точності аналізу рекомендується використовувати вторинні антитіла, які проходили процес перехресного адсорбування, щоб усунути щонайменші реакції з антитілом захоплення.

Порівняння прямих, непрямих і сендвіч-методів визначення ІФА

Прямий метод визначення ІФА

Переваги:

  • Швидкість, адже використовується тільки одне антитіло і менше етапів.
  • Виключається перехресна реактивність вторинних антитіл.

Недоліки:

  • Маркування ферментами-репортерами може негативно вплинути на імунореактивність первинного антитіла.
  • Висока вартість і витрати часу на маркування конкретних імуноглобулінів.
  • Обмежена кількість доступних кон’югованих антитіл.
  • Можлива відсутність вибору мітки для різних експериментів.
  • Мінімальне посилення сигналу.

Непрямий метод визначення ІФА

Переваги:

  • Широкий асортимент мічених вторинних антитіл.
  • Універсальність: до одного виду можна підготувати безліч первинних антитіл.
  • Максимальна імунореактивність завдяки немаркованому первинному антитілу.
  • Підвищена чутливість завдяки численним епітопам.
  • Можливість застосування різних методів детекції.

Недоліки:

  • Існує ризик перехресної реактивності вторинного антитіла, що може призвести до неспецифічного сигналу.
  • Потреба в додатковому етапі інкубації.

Багатошаровий ІФА (сендвіч-ІФА)

Переваги:

  • Висока чутливість і специфічність завдяки використанню двох антитіл.
  • Можливість використання різних методів детекції з одним і тим самим антитілом для захоплення.

Недоліки:

  • Необхідність оптимізації для визначення пар антитіл та зменшення перехресної реактивності.

Планшети для ІФА

При розробці нового ІФА для конкретного антигену першим кроком є оптимізація умов покриття планшета антигеном або антитілом захоплення. Рекомендується розпочати з вибору мікропланшета, який має мінімальну зв’язуючу здатність білка 400 нг/см². Важливо також, щоб коефіцієнт варіації (CV) зв’язування білка був низьким (переважно <5%). Це дозволить обмежити відхилення в значеннях, які повинні бути ідентичними, між лунками і планшетами.

Вибір кольору планшета залежить від характеру сигналу. Прозорі полістиролові планшети з плоским дном підходять для колориметричних сигналів, тоді як чорні або білі непрозорі планшети використовуються для флуоресцентних і хемілюмінесцентних сигналів. Обов'язково перевіряйте планшети візуально перед використанням, адже дефекти чи подряпини на поверхні можуть призводити до спотворень під час аналізу даних.

Планшети для ІФА від Thermo Scientific представлені з різними поверхнями, що забезпечують оптимальне нанесення макромолекул. Ці планшети розроблені для досягнення високої точності результатів і надійної відтворюваності.

Покриття пластин відбувається через пасивну адсорбцію білка на пластиковій поверхні мікропланшета. Цей процес зумовлений гідрофобними взаємодіями між пластиком і неполярними залишками білка. Для оптимального зв’язування деяких білків можуть знадобитися особливі умови або попередня обробка матеріалу.

Найпоширеніший метод покриття полягає в додаванні 2-10 мкг/мл розчину білка, який розчиняється в лужному буфері, наприклад, в фосфатно-буферному сольовому розчині (pH 7,4) або карбонатно-бікарбонатному буфері (pH 9,4). Після цього планшет інкубується протягом кількох годин або на ніч при температурі від 4 до 37°С.

По закінченні інкубації слід видалити розчин, а потім додати блокувальний буфер, який покриє всі доступні зв’язувальні поверхні пластикової лунки. Це важливий етап для зменшення неселективних взаємодій.

Планшети з покриттям можна використовувати відразу або висушити та зберігати при 4°С для подальшого використання, що залежить від стабільності покритого білка.

Застосування ІФА аналізу

Імуноферментний аналіз крові є специфічним методом діагностики, який, завдяки високій чутливості реакцій, дозволяє виявляти такі захворювання, як вірусні гепатити, онкологію, бактеріальні та паразитарні інфекції, а також аутоімунні хвороби.

Цей метод дослідження став незамінним у сучасній медицині, оскільки забезпечує точні результати та швидку діагностику.

У нашій компанії Інтермедика ви знайдете необхідне обладнання для проведення якісного та оперативного аналізу, що сприятиме точному визначенню захворювань.

Наша мета – полегшити доступ до якісних медичних послуг та зробити діагностику більш ефективною.

Сучасні ІФА аналізатори від Інтермедика

Для проведення якісних імуноферментних досліджень необхідне професійне обладнання. Компанія Інтермедика пропонує широкий вибір ІФА аналізаторів https://intermedica.com.ua/ua/katalog/laboratorija/immunofermentnye-analizatory від провідних світових виробників.

Наші переваги:

  • Великий вибір лабораторного обладнання в Україні https://intermedica.com.ua
  • Професійні консультації з підбору техніки
  • Повне технічне обслуговування
  • Навчання персоналу
  • Гарантійна та післягарантійна підтримка

Інтермедика - це надійний партнер для оснащення сучасних діагностичних лабораторій. Ми допоможемо підібрати оптимальне обладнання для ваших потреб та забезпечимо його безперебійну роботу.